Szülővárosában, Debrecenben a református főgimnáziumban érettségizett 1886-ban. Eredetileg teológiai pályára készülve, elvégezte a debreceni református teológia képzését, ahol 1890-ben végzett. Egyetemi tanulmányait 1893/94-ben a berlini egyetem bölcsészkarán kezdte, majd a következő évtől a budapesti egyetemen folytatta, ahol Bogáti Fazekas Miklósról írt értekezésével bölcsészdoktori oklevelet szerzett (1895). Ezután az Egyetemi Könyvtár másodosztályú könyvtártisztje lett (1895–1906). Tudományos kutatásai nyomán 1902-ben a budapesti egyetem a régibb magyar irodalom történetéből (1526–1772) témakörből magántanárrá habilitálta, s óraadói státuszt adott számára. Ebben a korszakban bontakozott ki igazán tudományos pályafutása, ugyanis egymás után jelentek meg alapos tudományos felkészültséggel írott művelődéstörténeti, könyvtártörténeti és bibliográfiai cikkei és tanulmányai: Bogáti Fazekas Miklós élete és költői működése (1895), Szenczi Molnár Albert (1897), Magyar író és könyvnyomtató a XVII. században (1899), Az irodalomtörténet módszerei (1903), A magyar irodalomtörténeti kutatás feladatairól (1904), Adatok a mértékes verselés történetéhez (1904), Balassa és Rimay Istenes énekeinek bibliographiája (1905), Adalékok a magyarországi nyomtatványok bibliographiájához (1906). Az MTA 1906-ban választotta levelező tagjává (rendes tag 1923-ban). Ugyanebben az évben elnyerte a kolozsvári tudományegyetemen a magyar irodalomtörténet nyilvános rendes egyetemi tanári állását. Kolozsvári korszakának kiemelkedő művei közül felsorolandó: Tinódi széphistóriája Jasonról (1907), Arany János irodalomtörténete (1908), Tinódi Sebestyén (1912), Báró Jósika Miklós 1794-1865 (1916).

Az 1920-ban, a Kolozsvárról való elűzésekor, Dézsi Lajos jelentős munkásságot tudhatott maga mögött, és nagy tanári gyakorlattal rendelkezett. Az egyetemet követve, 1921-ben Szegedre költözött, ahol Ferenc József Tudományegyetemen a Magyar Irodalomtörténeti Intézet igazgatója lett, miközben felesége és két lánya Budapesten lakott. Tanítványai között szerepelt József Attila, Radnóti Miklós, Bálint Sándor, Ortutay Gyula, Tolnai Gábor. Tanszékvezetői időszaka alatt egészen 1930-ig, Sík Sándor kinevezéséig a szegedi magyar irodalomoktatásban az újabb korok irodalma háttérbe szorult. Előadásait a 16. század, Balassi Bálint költészete, a barokk epika (Pázmány, Zrínyi, Gyöngyösi századának irodalma) Jósika Miklós témakörében hirdette. Nagyon jelentős szerkesztői tevékenységet is folytatott: szerkesztette a Magyar Történeti Életrajzokat, a Magyar Irodalomtörténeti Értekezéseket és a Világirodalmi lexikont (1930–1932).

Folyamatosan viselt valamilyen egyetemi tisztséget: dékán (1922/23), prodékán (1923/24), rektor (1928/29) és prorektor (1921/22, 1929/30). Fő kutatási területe a 16–17. századi magyar irodalomtörténet volt, de bibliográfusként is jelentőset alkotott. Apponyi Sándor hungarica-gyűjtésének befejezője, a régi magyar könyvészet avatott szakembere volt.

Kolozsvárról kimenekített magánkönyvtára a rövid ideig (1922–1924) általa igazgatott szegedi egyetemi könyvtár fontos alapítógyűjteménye lett. A Klebelsberg Könyvtár őrzi kézirathagyatékát is, melynek tekintélyes részét koraújkori irodalmi szövegek, kódexek másolatai és ezekhez készült jegyzetek teszik ki. Emlékét a kolozsvári egyetem Bölcsészettudományi Kar épületében egy róla elnevezett szemináriumi terem őrzi.